|
====Competència artificial====
LaLa competència artificial no es codifica als gens de la cèl·lula. En canvi és provocat per procediments de laboratori en els quals les cèl·lules es fan passivament permeables a l'ADN, utilitzant condicions que no ocorren normalment a la natura.<ref>Large-volume transformation with high-throughput efficiency chemically competent cells. Focus 20:2 (1998). {{en}}</ref>
Les cèl·lules es refreden en presència de [[catió divalent|cations divalents]] com [[Calci|Ca<sup>2+</sup>]] (en [[clorur de calci|CaCl<sub>2</sub>]]) això prepara les parets cel·lulars i les torna permeables a l'ADN del [[plasmidi]]. Les cèl·lules s'incuben en gel amb l'ADN i llavors es realitza un breu xoc tèrmic (p. ex. 42 °C durant 30-120 segons), la qual cosa fa que l'ADN ingressi a la cèl·lula. Aquest mètode funciona molt bé per als plasmidis circulars d'ADN. Una preparació excel·lent de cèl·lules competents donarà colònies a ~10<sup>8</sup> per micro[[gram]] (μg) de plasmidi. Una preparació pobra estarà sobre 10<sup>4</sup>/g o menys. Les bones preparacions no comercials n'haurien de donar 10<sup>5</sup> a 10<sup>6</sup> transformants per μg de plasmidi.
ElEl mètode normalment no funciona bé per a molècules lineals com ara fragments de [[DNA cromosòmic]], probablement perquè els [[enzims]] d'[[exonucleasa]] a la cèl·lula ràpidament degraden el DNA lineal. Tanmateix, les cèl·lules que són naturalment competents es transformen normalment més eficaçment amb DNA lineal que amb plasmidis.
L'[[electroporacióelectroporació]] és una altra manera de fer forats breument en cèl·lules (bacterianes i algunes [[eucariota|eucariotes]]) impressionant-los amb un [[camp elèctric]] de 10-20 k[[volt|V]]/cm. Els plasmidis poden introduir-se a la cèl·lula a través d'aquests forats. Aquest mètode és flexible per utilitzar amb DNA de plasmidis relativament grans.<ref>Transformation efficiency of E. coli electroporated with large plasmid DNA. Focus 20:3 (1998). {{en}}</ref>els mecanismes de reparació naturals de la membrana tancaran ràpidament aquests forats després de la ruptura.
=====Transformació per plasmidis=====
PerPer tal de persistir i ser mantingut de forma estable a la cèl·lula, una molècula de DNA plasmídic ha de contenir un [[origen de replicació]], que el permet ser duplicat a la cèl·lula de forma independent del cromosoma (el nombre de còpies és variable podent variar usualment entre la desena i el centenar de 100 còpies de cada plasmidi per cèl·lula). Perquè la transformació normalment produeix una mescla de cèl·lules transformants rares i cèl·lules no-transformants abundants, es necessita un mètode que permeti identificar i seleccionar les cèl·lules que han adquirit els gens en un procés de modificació genètica (marcadors genètics o bioquímics). Els plasmidis utilitzats en experiments de transformació generalment contindran un gen que aporti resistència a un [[antibiòtic]] al qual els bacteris transfectats són sensibles. Les cèl·lules capaces de créixer en el medi que conté aquest antibiòtic hauran estat transformades pel plasmidi, així les cèl·lules que no hagin incorporat el plasmidi seran incapaces de multiplicar-se.
UnUn altre marcador, utilitzava per identificar cèl·lules d'[[E. coli]] que han adquirit plasmidis recombinants, és el gen de [[lacZ]], que codifica per a la β-[[galactosidasa]]. Perquè -galactosidasa és un tetràmer homo, amb cada monòmer constituït per un lacZ-α i una proteïna de lacZ-ω, si només s'expressa una de les dues proteïnes necessàries a la cèl·lula, no es formarà cap enzim funcional. Així, si una pressió d'''E. coli'' sense lacZ-α en el seu genoma és transformat utilitzant com plasmidi que conté el fragment de gens desapareguts, les cèl·lules transformades produiran β-galactosidasa, mentre cèl·lules no transformants, només són capaces de produir la meitat d'omega del [[monòmer]]. EnEn aquest tipus de transformació, la regió ''polilinker'' del plasmidi és en el fragment de gens de lacZ-α, significant que els plasmidis recombinats reeixidament produïts tindran el gen desitjat introduït a algun lloc dins de lacZ-α. Quan aquest fragment de gens interromput és expressat per ''E. coli'', cap proteïna de lacZ-α utilitzable no es produeix, i per això cap β-galactosidasa utilitzable no es forma. Quan creix en medis de cultiu que contenen el sucre de [[galactosa]] modificada incolora (X-gal) les colònies que poden metabolitzar el [[Substrat (biologia cel·lular)|substrat]] (han resultat transformades, però no per plasmidis recombinants) apareixeran tenyides de color blau; les colònies que no poden metabolitzar el substrat (transformades per plasmidis recombinants) seran blanques.
===Plantes===
* ''[[Agrobacterium]]'' és usat amb preferència per davant d'altres mètodes per a transformar plantes per la seva simplicitat i facilitat tecnològica. El teixit de la planta, sovint fulles, es talla en trossos petits, p. ex. 10 x 10 [[mm]], i incubades durant 10 minuts en una suspensió líquida que conté ''Agrobacterium''. Algunes cèl·lules al llarg del tall seran transformades pel bacteri, que introdueix el seu DNA a la cèl·lula. Després són col·locades en medis de cultiu d'arrelament seleccionables on les plantes creixeran. Algunes espècies es poden transformar només submergint les flors a suspensions d'''Agrobacterium'' i aleshores se sembren les [[llavors]] en un medi selectiu. Desafortunadament, algunes plantes no són transformables per aquest mètode.
* [[Electroporació]]: realitzar forats en la membrana cel·lular usant descàrregues elèctriques. Això permet l'entrada de l'ADN.
* [[Pistola de gens|Bombardeig de partícules]]: Petites partícules d'[[or]] o de [[tungstè]] recobertes d'ADN es disparen a cèl·lules de plantes joves o [[embrió|embrions]] de planta. Una mica de material genètic restarà a les cèl·lules i les transformarà. Aquest mètode també permet la transformació amb [[plastidi]]s vegetals. L'eficiència de transformació és més baixa del que en el cas d'''Agrobacterium'' aconseguit la transformació, però la majoria de les plantes es poden transformar amb aquest mètode.
* [[TransformacióTransformació vírica]] ([[transducció]]): El material genètic desitjat és empaquetat dins d'un [[virus]] vegetal adequat; és aquest virus modificat el que infecta la planta. Si el material genètic és ADN, es pot recombinar amb els cromosomes per produir cèl·lules transformants. Tanmateix els genomes de la majoria dels virus vegetals consten de RNA monocatenari que es duplica al [[citoplasma]] de cèl·lula infectada. Per a tals genomes aquest mètode és una forma de transfecció i no una transformació genuïna, ja que els gens introduïts mai no arriben al nucli cèl·lular i no s'integren a la genoma de l'hoste. La [[progènie]] de les plantes infectades és lliure de virus i del del gen introduït.
===Animals===
| 