Centrifugació diferencial: diferència entre les revisions

La ultracentrifugació va ser inventada per [[Theodor Svedberg]], físic i químic suec, al voltant de l'any [[1926]]. Es tracta d'un mètode de separació de components en el que es generen [[força centrífuga|forces centrífugues]] que arriben a una força 500.000 vegades superior a la [[força de gravetat]], ja que les [[ultracentrífuga|ultracentrífugues]] treballen a velocitats entre 15.000 [[revolució per minut|rpm]] i 75.000 rpm, provocant la [[sedimentació]] de les partícules més grans al fons del tub i evitant la seva difusió. A l'hora de realitzar una [[ultracentrifugació]], s'ha de tenir en compte el principi de [[Resistència elèctrica (propietat)|resistència]] per fricció; és per això que s'ha de realitzar en un ambient blindat i pràcticament [[buit]]. Hi ha dos tipus de separació d'àcids nucleics per ultracentrifugació: la '''sedimentació per velocitat''' i la '''centrifugació d'equilibri'''.

==Sedimentació per velocitat==

En la sedimentació per velocitat les molècules d'àcid nucleic se separen segons la longitud del nucleòtid. Habitualment, el tub d'ultracentrifugació conté prèviament un gradient de [[densitat]] discontinu de solucions amb una concentració creixent de [[sacarosa]]; també es poden utilitzar gradients de densitat de [[glicerol]] o de sals de [[cesi]] com el clorur o el [[trifluoroacetat]]. Per tant, les solucions constituents d'aquest gradient són cada vegada més denses i viscoses des de la superfície al fons del tub. La mostra que conté la barreja de molècules d'àcid nucleic a separar, es deposita acuradament al tub, aquest s'introdueix a la ultracentrífuga i comença el procés de separació. La sedimentació per velocitat es basa en el fet que les molècules d'àcid nucleic, a grans forces centrífugues, es desplacen pel gradient a una velocitat que ve determinada pel seu [[coeficient de sedimentació]] (S). El coeficient de sedimentació d'una partícula o macromolècula és el quocient de la seva velocitat constant de sedimentació v (en m/s) i l'acceleració aplicada per la ultracentrífuga c (en m/s²).

Quan més gran és el coeficient de sedimentació (S) d'un àcid nucleic, més lluny es mou aquest en un període determinat d'ultracentrifugació, i per tant, més s'enfonsa en el tub. Al treure la mostra de la ultracentrífuga, aquesta es troba fraccionada: els àcids nucleics es troben separats per mida. L'alta viscositat del component del gradient (sacarosa, glicerol, etc.), impedeix que els àcids nucleics fraccionats es barregin per convecció o manipulació, fent que els que tenen valors idèntics de S es trobin en un mateix nivell formant una banda. Amb aquesta tècnica, es pot identificar el valor de S de molècules de DNA introduint al tub marcadors de S conegut.

Aquesta tècnica d'ultracentrifugació s'empra per separar molècules àcids nucleics amb el mateix coeficient de sedimentació (S) segons la seva densitat de flotació. Generalment, en aquest procediment s'utilitzen solucions molt concentrades de sals de cesi (clorur de cesi o sulfat de cesi), en les que s'introdueix la barreja de DNA. Seguidament s'inicia un procés d'ultracentrifugació prolongat (de dos a tres dies de duració). Durant la ultracentrifugació prolongada, els ions de cesi es dirigeixen lentament al fons del tub formant d'aquesta manera un gradient de densitat continu en tota la columna de líquid. Posteriorment el gradient s'estabilitza per la tendència natural de difusió dels ions. A mesura que es forma aquest gradient, les molècules individuals de DNA es mouen per flotació fins que arriben a una posició amb una densitat de flotació equivalent a la pròpia, en la qual s'aturen. Aquesta tècnica permet separar molècules de DNA amb diferent composició de [[bases nitrogenades]] per tant d'àcids nucleics.