|
====Competència artificial====
La competència artificial no es codifica als gens de la cèl·lula. En canvi és provocat per procediments de laboratori en els quals les cèl·lules es fan passivament permeables a DNAl'ADN, utilitzant condicions que no ocorren normalment a la natura.<ref>Large-volume transformation with high-throughput efficiency chemically competent cells. Focus 20:2 (1998). {{en}}</ref>
Les cèl·lules que es refreden en presència de [[catió divalent|cations divalents]] com [[Calci|Ca<sup>2+</sup>]] (en [[clorur de calci|CaCl<sub>2</sub>]]) això prepara les parets cel·lulars i les torna permeables a l'ADN del [[plasmidi]]. Les cèl·lules s'incuben en gel amb l'ADN i llavors es realitza un breu xoc tèrmic (p. ex. 42 °C durant 30-120 segons), la qual cosa fa que l'ADN ingressi a la cèl·lula. Aquest mètode funciona molt bé per als plasmidis circulars d'ADN. Una preparació excel·lent de cèl·lules competents donarà colònies a ~10<sup>8</sup> per micro[[gram]] (μg) de plasmidi. Una preparació pobra estarà sobre 10<sup>4</sup>/g o menys. ElsLes bonsbones prepspreparacions no comercials n'haurien de donar 10<sup>5</sup> a 10<sup>6</sup> transformants per microgramμg de plasmidi.
El mètode normalment no funciona bé per a molècules lineals com ara fragments de [[DNA cromosòmic ]], probablement perquè els enzims[[enzim]]s d' [[exonucleasa ]] a la cèl·lula ràpidament degraden el DNA lineal. Tanmateix, les cèl·lules |cel·les que són naturalment competents es transformen normalment més eficaçment amb DNA lineal que amb plasmidis. ▼Artificial competence is not encoded in the cell's genes. Instead it is induced by laboratory procedures in which cells are passively made permeable to DNA, using conditions that do not normally occur in nature.
Chilling cells in the presence of [[divalent]] [[cation]]s such as Ca<sup>2+</sup> (in [[calcium chloride|CaCl<sub>2</sub>]]) prepares the cell walls to become permeable to [[plasmid|plasmid DNA]]. Cells are incubated on ice with the DNA and then briefly heat shocked (eg 42 °C for 30–120 seconds), which causes the DNA to enter the cell. This method works very well for circular plasmid DNAs. An excellent preparation of competent cells will give ~10<sup>8</sup> colonies per microgram of plasmid. A poor preparation will be about 10<sup>4</sup>/μg or less. Good non-commercial preps should give 10<sup>5</sup> to 10<sup>6</sup> transformants per microgram of plasmid.
L'[[electroporació]] és una altra manera de fer forats breument en cèl·lules (bacterianes i algunes [[eucariota|eucariotes]]) impressionant-los amb un [[camp elèctric]] de 10-20 k[[volt|V]]/cm. Els plasmidis poden introduir-se a la cèl·lula a través d'aquests forats. Aquest mètode és flexible per utilitzar amb DNA de plasmidis relativament grans. <ref>Transformation efficiency of E. coli electroporated with large plasmid DNA. Focus 20:3 (1998). {{en}}</ref>els mecanismes de reparació naturals de la membrana tancaran ràpidament aquests forats després de la ruptura.
▲El mètode normalment no funciona bé per a molècules lineals com ara fragments de DNA cromosòmic, probablement perquè els enzims d'exonucleasa a la cèl·lula ràpidament degraden DNA lineal. Tanmateix, les cèl·lules|cel·les que són naturalment competents es transformen normalment més eficaçment amb DNA lineal que amb plasmidis.
=====Transformació per plasmidis=====
The method usually does not work well for linear molecules such as fragments of chromosomal DNA, probably because [[exonuclease]] enzymes in the cell rapidly degrade linear DNA. However, cells that are naturally competent are usually transformed more efficiently with linear DNA than with plasmids.
Per tal de persistir i ser mantingut de forma estable a la cèl·lula, una molècula de DNA plasmídic ha de contenir un [[origen de replicació]], que el permet ser duplicat a la cèl·lula de forma independent del cromosoma (el nombre de còpies és variable podent variar usualment entre la desena i el centenar de 100 còpies de cada plasmidi per cèl·lula). Perquè la transformació normalment produeix una mescla de cèl·lules transformants rares i cèl·lules no-transformants abundants, es necessita un mètode que permeti identificar i seleccionar les cèl·lules que han adquirit els gens en un procés de modificació genètica (marcadors genètics o bioquímics). Els plasmidis utilitzats en experiments de transformació generalment contindran un gen que aporti resistència a un [[antibiòtic]] al qual els bacteris transfectats són sensibles. Les cèl·lules capaces d'arribar a agradar als mitjans de comunicació que contenen aquest antibiòtic hauran estat transformades pel plasmidi, així les cèl·lules que no hagin incorporat el plasmidi seran incapaces de multiplicar-se.
Un altre marcador, utilitzava per identificar cèl·lules d'[[E. coli]] que han adquirit plasmidis recombinants, és el gen de [[lacZ]], que codifica per a la β-[[galactosidasa]]. Perquè -galactosidasa és un tetràmer homo, amb cada monòmer constituït per un lacZ-α i una proteïna de lacZ-ω, si només s'expressa una de les dues proteïnes necessàries a la cèl·lula, no es formarà cap enzim funcional. Així, si una pressió d'''E. coli'' sense lacZ-α en el seu genoma és transformat utilitzant com plasmidi que conté el fragment de gens desapareguts, les cèl·lules transformades produiran β-galactosidasa, mentre cèl·lules no transformants, només són capaces de produir la meitat d'omega del [[monòmer]]. En aquest tipus de transformació, la regió ''polilinker'' del plasmidi és en el fragment de gens de lacZ-α, significant que els plasmidis recombinats reeixidament produïts tindran el gen desitjat introduït a algun lloc dins de lacZ-α. Quan aquest fragment de gens interromput és expressat per ''E. coli'', cap proteïna de lacZ-α utilitzable no es produeix, i per això cap β-galactosidasa utilitzable no es forma. Quan creix en medis de cultiu que contenen el sucre de [[galactosa]] modificada incolora (X-gal) les colònies que poden metabolitzar el [[substrat]] (han resultat transformades, però no per plasmidis recombinants) apareixeran tenyides de color blau; les colònies que no poden metabolitzar el substrat (transformades per plasmidis recombinants) seran blanques.
[[Electroporation]] is another way to make holes in bacterial (and other) cells, by briefly shocking them with an [[electric field]] of 10-20[[Volt|kV]]/cm. Plasmid DNA can enter the cell through these holes. This method is amenable to use with large plasmid DNA. <ref>Transformation efficiency of E. coli electroporated with large plasmid DNA. Focus 20:3 (1998).</ref> Natural membrane-repair mechanisms will rapidly close these holes after the shock.
=====Plasmid transformation=====
In order to persist and be stably maintained in the cell, a plasmid DNA molecule must contain an [[origin of replication]], which allows it to be replicated in the cell independently of the chromosome. Because transformation usually produces a mixture of rare transformed cells and abundant non-transformed cells, a method is needed to identify the cells that have acquired the plasmid. Plasmids used in transformation experiments will usually also contain a gene giving resistance to an antibiotic that the intended recipient strain of bacteria is sensitive to. Cells able to grow on media containing this antibiotic will have been transformed by the plasmid, as cells lacking the plasmid will be unable to grow.
Another marker, used for identifying ''[[E. coli]]'' cells that have acquired recombinant plasmids, is the ''lacZ'' gene, which codes for [[Beta-galactosidase|β-galactosidase]]. Because β-galactosidase is a homo-[[tetramer]], with each monomer made up of one ''lacZ-α'' and one ''lacZ-ω'' protein, if only one of the two requisite proteins is expressed in the resulting cell, no functional enzyme will be formed. Thus, if a strain of ''E. coli'' without ''lacZ-α'' in its genome is transformed using as plasmid containing the missing gene fragment, transformed cells will produce β-galactosidase, while untransformed cells will not, as they are only able to produce the omega half of the monomer. In this type of transformation, the [[Multiple cloning site|polylinker]] region of the plasmid lies in the ''lacZ-α'' gene fragment, meaning that successfully produced recombinant plasmids will have the desired gene inserted somewhere within ''lacZ-α''. When this disrupted gene fragment is expressed by ''E. coli'', no usable ''lacZ-α'' protein is produced, and therefore no usable β-galactosidase is formed. When grown on media containing the colorless, modified galactose sugar [[X-gal]], colonies that are able to metabolize the substrate (and that have therefore been transformed, but not by recombinant plasmids) will appear blue in color; colonies that are not able to metabolize the substrate (and that have therefore been transformed by recombinant plasmids) will appear white.
===Plantes===
| 